臭氧预处理可影响氯胺酮对脓毒症大鼠肝脏NF-κB的作用
臭氧预处理可影响氯胺酮对脓毒症大鼠肝脏NF-κB的作用
孙文冲，裴凌
摘要：目的探讨臭氧氧化预处理是否与氯胺酮对脓毒症大鼠模型肝脏NF-κB的治疗有协同作用。方法选择健康雄性Wistar大鼠40只，随机分为5组（n=8）：对照组（control group）大鼠按照给药组对应时间腹腔注射等量生理盐水1ml/kg，内毒素（脂多糖）组和内毒素组+氯胺酮组（脂多糖+KT group）分别在注射等量生理盐水或氯胺酮前腹腔注射脂多糖20mg/kg，O3/O2+内毒素+氯胺酮组（group O3/O2+ LPS + KT）与O3/O2+内毒素组（O3/O2group+脂多糖）都是在腹腔内注射O3/O2混合物15ug/kg连续5天，末次注射24h后予脂多糖20mg/kg,而后两组分别给予氯胺酮5mg/kg或生理盐水1ml/kg。各组在注射2h后处死动物取标本，制备肝组织病理切片。SABC（Strept Avidin Blotin Complex）法测定肝组织中NF-κB的活化程度，光镜下观察肝脏组织学改变。结果对照组肝组织形态正常，NF-κB活化极少；内毒素组肝细胞明显肿胀，肝小叶结构紊乱，窦隙变宽，肝细胞和内皮细胞普遍水肿变性，部分可见局灶性坏死区，汇管区炎细胞浸润，NF-κB活化最为明显（37.139±19.294 VS7.467±6.073）（P<0.05)；O3/O2+内毒素+氯胺酮组肝组织较内毒素+氯胺酮组改变减轻，肝细胞轻度肿胀但肝组织结构尚完整，NF-κB呈低度活化（8.213±3.438VS12.500±4.685）（P<0.05)。结论脓毒症肝损伤时，O3氧化预处理可抑制NF-κB活化并协同氯胺酮的抗炎作用，从而减轻肝组织的病理损伤。
【关键词】肝脏核因子κB大鼠
Efficiencyof ketamine on nuclear factor kappa B activities is influenced after ozone oxidative preconditioning in sepsis-induced liver injury in rats.SUN Wen-chong,PEI Ling.Department of Anesthesiology, First Affiliated Hospital，China Medical University,Shenyang110001,China
【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of ozone oxidative preconditioning on serum NF-κBlevels in endotoxic shock model(rats treated with lipopolysaccharide (LPS))．Methods.Following mixture gas of 5%O3and 95% O215μg/kginjection for 5 days,20mg/kg LPS was infused after 24 hours in the group O3/O2+LPS+KT and O3/O2+LPS group,and then 5mg/kg ketamine and 1ml/kg saline was injected respectively.In addition to histological examination of the liver，the activity of NF-κB was determined by SABC immunohistochemistry were respectively measured in each group.Results Histological damage occurred in LPS group．It was characterized by hepatic arrangement turbulence，hepatic lobules distortion，congestion in liver sinusoids，hepatocyte swelling or necrosis，and granulocytes infiltration．These changes were not markedly obvious in LPS+ketamine+ozone group.Normal control group have quite low activity of NF-κB，but the activity of NF-κB was markedly increased in LPS group(P<0.05)．NF-κB level was significantly decreased in O3+ LPS+ketamine group (P<0.05)when compared with LPS+ketamine group,almost equal to control group. Conclusion The preconditioning effect of ozone seems to support the biological effectiveness of ketamine by altering the nuclear factor kappaB activity ,which may play an important role in sepsis-induced liver injury in rats．Forty healthy Wistar rats were randomly divided into 5 groups（n=8 each）：LPS treated and LPS-pretreated rats were administrated respectively with 1ml/kg saline and 5mg/kgketamine followed by infusion with 20mg/kg LPS.An equivalent amount of saline was injected in the control rats
【Key words】Liver injury; NF-κB; Rat
脓毒症是严重创伤、休克、大手术后常见的并发症，是危重病症中最常见的死亡原因[1]。它多由细菌胞壁外膜外联的脂多糖与内毒素受体相互作用而触发，再通过一系列细胞内信号转导机制激活核转录因子B(NF-κB)，促进肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)等细胞因子在体内大量表达，引发机体产生过度的炎性反应。肝脏是内毒素脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)的主要解毒器官，在脓毒症器官损害的发生、发展中具有重要调控作用。已有文献报道静脉麻醉药氯胺酮(Ketamine，KT)具有抗感染性休克和抗炎效应,可减轻脂多糖引起的肝损害，抑制NF-κB的激活[2]。随着研究的深入，臭氧已被广泛应用于临床多种疾病的治疗过程中（如疼痛性疾病，缺血性疾病等），尤其是在重度感染的防治中发挥了重要的作用[3]。本研究拟通过对脓毒症大鼠模型NF-κB活性的检测探讨O3预处理对氯胺酮抗炎作用的影响及肝组织的病理学变化。
l材料与方法
1.1材料
健康清洁级雄性Wistar大白鼠40只，SPF级，周龄6-8w，体重230-250g，供给无菌食料和饮水（由中国医科大学实验动物供应科提供）。
1.2实验分组
选择Wistar大鼠40只，随机分为5组(n=8)
Ⅰ对照组按照给药组对应时间腹腔注射等容量生理盐水1.0ml/kg
ⅡLPS +NS组将内毒素(LPS，E.coli O55:B5, Sigma公司,美国)溶于2.5ml生理盐水中，大鼠腹腔注射20mg/kg，随后注射生理盐水1.0ml/kg
ⅢLPS+氯胺酮组大鼠腹腔注射LPS（同Ⅱ），随后立即腹腔注射盐酸氯胺酮注射液5mg/kg（批号：070522，福建古田药业有限公司）
ⅣO3/O2+ LPS+氯胺酮组腹腔注射浓度40μg/mlO3/O2混合物（O3约占5%，O2约占95%）1ml（约150ug/kg）连续5天，均在9：00-10：00AM注射，末次注射24h后腹腔注射LPS（同Ⅱ），而后立即腹腔注射氯胺酮（同Ⅲ）
ⅤO3/O2+LPS+NS组腹腔注射O3/O2混合物(同Ⅳ组),末次注射24h后腹腔注射LPS（同Ⅱ），而后立即腹腔注射NS（同Ⅱ）。
各组于注射后2h处死动物，剖腹，心脏灌流后取肝脏组织。
1.3测定指标
以4%多聚甲醛200ml心脏灌流处死大鼠，取新鲜肝组织用4%多聚甲醛液固定后石蜡包埋，5-6 m厚连续切片制备石蜡切片。部分切片用SABC法进行免疫组织化学染色，严格按试剂盒使用说明操作。NF-KB单克隆抗体(McAb)(武汉博士德生物工程公司)；即用型SABC试剂盒(武汉博士德生物工程公司)
1.4形态学观察
另一部分石蜡切片进行常规HE染色，BX-51光学显微镜(Olympus公司，日本)下观察组织形态学变化。
1.5结果判定
每只动物随机取两张免疫组化切片检测肝组织NF-κB表达（以积分光密度表示），每张切片在400倍光镜下随机取五个视野，采用显微摄像系统(Olympus AX70,日本)对肝组织切片中显示细胞浆或细胞核中有棕黄色颗粒的阳性细胞进行图像采集。采用高清晰度彩色显微图像分析系统（MetaMorph/Olympus DP10/BX51，日本）对阳性细胞进行分析。用Image Pro Plus 5.0图像分析软件对积分光密度值进行统计分析，比较各组间的表达量差异。
1.6统计学处理
采用SPSS11.5统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差( x ±s)表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）,均数间的两两比较采用Dunnett-t检验，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为有非常显著性差异。
2.结果所有大鼠均顺利完成实验，各组大鼠体重差异无统计学意义（P>0.05）
2.1肝组织NF-κB表达的变化
NF-κB在细胞浆或细胞核中有棕黄色颗粒者表达，其积分光密度值见表1，Ⅰ组中大鼠肝组织NF-κB表达极少；Ⅱ组注射LPS后NF-κB的表达显著增加（P<0.05）, Ⅲ、Ⅳ组、Ⅴ较Ⅱ表达量都显著降低（P<0.05），且Ⅳ组显著低于Ⅲ组（P<0.05）；Ⅳ组NF-κB的表达量几乎下降到Ⅰ组的水平，两组相比无统计学意义（P>0.05）。
表1各组大鼠肝组织NF-κB的表达的积分光密度值比较(x ±s，n=10)
组别
例数
NF-κB
Ⅰ对照组
10
7.467±6.073
ⅡLPS+NS组
10
37.139±19.2940△
ⅢLPS+ KT组
10
12.500±4.685△*
ⅣO3/O2+ LPS+KT组
10
8.213±3.438*#
ⅤO3/O2+LPS+NS组
10
8.889±2.716*#
注：△与Ⅰ组比较, P < 0. 05 *与Ⅱ组比较,P < 0.01 #与Ⅲ组比较，P < 0.05
2.2光镜下肝病理学改变HE染色显示
Ⅰ组：肝小叶结构完整清晰，肝细胞形态结构正常，肝窦清晰，无中性粒细胞浸润（图1）；Ⅱ组：可见肝细胞明显肿胀，细胞和内皮细胞普遍水肿变性，肝小叶结构紊乱，肝界板破坏，窦隙变宽，窦腔内有炎细胞聚集成团，汇管区有较多炎细胞浸润，部分可见局灶性坏死区，部分细胞核呈碎裂状，肝血窦内有淤积的红细胞和微血栓（图2）；Ⅳ组：肝细胞轻度肿胀，但肝细胞膜完好，肝组织结构基本完整，肝血窦轻度扩张，肝组织中可见少量散在的炎性细胞浸润（图4）；Ⅲ、Ⅴ组表现类似：肝细胞明显肿胀，有的呈空泡状变性，肝血窦受压，但肝组织结构尚完整，炎性细胞在肝组织中大量散在分布（图3）。
Ⅰ组(对照组)Ⅱ组（LPS+NS组）
Ⅲ组（LPS+KT组）Ⅳ组（O3/O2+LPS+KT组）
图A对照组肝小叶结构完整清晰，肝细胞形态结构正常，无中性粒细胞浸润。HE×400
图BLPS+NS组肝细胞明显肿胀，肝小叶结构紊乱，汇管区有较多炎细胞浸润，部分可见局灶性坏死区，部分细胞核呈碎裂状。HE×400 图C LPS+ KT组肝细胞明显肿胀，有的呈空泡状变性但肝组织结构尚完整，炎性细胞在肝组织中大量散在分布。HE×400 图DO3/O2+ LPS+KT组肝细胞轻度肿胀，肝组织结构基本完整，肝组织中可见少量散在的炎性细胞浸润。HE×400
2.3 NF-κB免疫组化染色结果
在LPS组大鼠肝细胞胞浆及胞核中均有NF-κB强阳性染色，即呈棕黄色颗粒的为阳性细胞；在LPS+KT组，NF-κB的表达较LPS组减少（P<0.05）；而在O3/O2+LPS+KT组, NF-κB的表达较LPS组和LPS+KT组均减少（P<0.05）。见表1，图5~7。
图E LPS组大鼠肝细胞胞浆及胞核中均有NF-κB强阳性染色。（DAB显色，×400）图FLPS+KT组，NF-κB的表达较LPS组减少。（DAB显色，×400）图G O3/O2+LPS+KT组NF-κB的表达较LPS组和LPS+KT组均减少。（DAB显色，×400）
3.讨论
1994年，NF-κB在肝脏疾病中作为重要因子第一次被认识【4】。NF-κB是许多炎症介质表达所必需的转录因子，重要炎性因子(IL-6、IL-8)和细胞粘附分子(ICAM-1、VCAM-1)的基因启动子上都有NF-κB的结合位点，即NF-κB是促炎性细胞因子的上游基因。哺乳动物最多见的NF-κB是由P65和P5O两个蛋白亚基组成的异源二聚体，它不仅在细胞内相对稳定表达而且是最重要的可被诱导的二聚体形式。在静息状态下，NF-κB的P65亚基与NF-κB抑制物（inhibitor ofκB，IκB）蛋白结合,覆盖P65蛋白的核定位信号,以无活性状态存在于胞浆中。在LPS、前炎性细胞因子等的刺激下，IκB蛋白Ser32和Ser36发生磷酸化而被降解，NF-κB激活后移位至细胞核，与靶基因启动子序列的特定部位结合，启动和调控众多炎症介质的基因转录[5]。因此，NF-κB可被认为是极具潜力的新型抗炎靶点，如能有效地拮抗NF-κB的活化，则可高效特异地抑制IL-6等炎症介质的释放，起到以一当十、事半功倍的抗炎效果。
本研究参照文献[6]介绍的方法，建立大鼠脓毒血症肝损伤动物模型，用SABC法检测大鼠肝组织中NF-κB活性。结果表明，Ⅱ组较Ⅰ组NF-κB的活性明显升高，表明脓毒血症肝损伤模型制备成功。进一步研究发现，NF-κB活性改变与肝脏结构的改变基本一致，从而提示NF-κB可能在大鼠感染性肝脏损伤中起关键性作用。
氯胺酮是唯一一种具有镇痛作用的静脉麻醉药，其对LPS引起的肝损伤有明确的治疗作用[6]。Jie等[7]指出氯胺酮在体内/外均可抑制内毒素诱导的NF-κB活化。本研究也发现，Ⅲ组的NF-κB活性较Ⅱ组明显降低，提示经氯胺酮处理后，脓毒血症大鼠肝组织NF-κB活性下降，即氯胺酮可抑制大鼠肝脏NF-κB活化，与Jie的研究结果及Taniguchi[8]等证实氯胺酮有肝保护的结论相一致。由此推测，氯胺酮可能正是通过抑制NF-κB的活化而减少TNF-α和IL-6的合成，从而拮抗肝脏过度的炎性反应，并对感染性休克动物其它重要脏器发挥保护作用。
O3进入血液后立即降解成反应性氧产物（reactive oxygen specis，ROS），其中以H2O2最为重要。H2O2可自由进出白细胞，活化特异性蛋白激酶和基因表达。被激活的免疫细胞释放细胞因子增强机体免疫应答。有文献报道[9]O3 /O2腹腔应用可以抑制内毒素大鼠NF-κB的激活,降低TNF-α的释放,避免慢性炎症反应的产生,阻止了内毒素休克的发展。但值得注意的是，O3的毒性/治疗双重作用取决于所用O3的浓度[10]。因过低浓度的O3无法启动细胞因子的级联反应，过高浓度的O3使机体遭受较强的氧化应激损害，故O3只有在治疗窗（0-60）μg/ml [10]范围内才能在损伤细胞之前被抗氧化和清除系统识别后清除，换句话说，O3在此范围内才可作为一种药物，故本实验选择40μg/ml。结果示，Ⅴ组与Ⅱ组比较，NF-κB含量明显降低（P<0.05)，说明40μg/ml的O3 /O2混合物对脓毒症大鼠NF-κB的激活有抑制作用;同时，与Ⅲ组相比，我们发现Ⅳ组NF-κB含量明显降低（P<0.05），说明O3 /O2混合物不仅抑制脓毒症大鼠肝脏NF-κB的激活，与氯胺酮的抗炎作用也有协同效应。
正常的氧化/还原系统动态平衡是机体进行正常免疫反应的关键因素，因为ROS在宿主防御过程中是一必备因素【11】。虽然本研究未对大鼠体内的氧化还原状态进行评价，但O3 /O2预处理是通过激活包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）在内的内源性抗氧化系统来限制脓毒血症造成的过度的氧化应激状态。Jacobs等【12】也指出SOD，GSH-Px等内源性抗氧化物质增多可使脓毒症大鼠生存率升高。所以，我们认为脓毒症大鼠腹腔应用治疗量的O3 /O2混合物是通过上调体内还原系统水平来协同氯胺酮的生物学效应。
本研究我们发现LPS致肝损伤的急性期，腹腔内注射氯胺酮和治疗量的O3 /O2都可以抑制NF-κB的活化，且治疗量的O3 /O2混合物可提高氯胺酮的抗炎效果，减轻内毒血症引起的器官、组织损害，降低术后脓毒症的发病率，避免慢性炎症反应和氧化应激的产生。
[1]姚咏明,盛志勇.脓毒症研究的若干新动态[J].中国危重病急救医学,2000,12(6):323- 325.
[2] Takenaka I,Ogata M,Koga K,et a1.Ketamine suppresses endotoxin induced tumor necrosis factor alpha production in mice. Anesthesiology,l994,80:402-408.
[3]Velio Alvaro Bocci.Scientific and medical aspects of ozone therapy.State of the art.Archives of medical research,2006,37:425-435.
[4]金山,戴朝六,韩喜春.NF-κB在大鼠肝缺血再灌注损伤中的活化及意义.实用肝脏病杂志, 2006, 9(1): 19-21.
[5]Abraham E.NF-κB activation,Crit Care Med,2000,28(4 Suppl):N 100-104.
[6]James W,Suliburk, MD, Kenneth S,et al.Ketamine attenuates liver injury attributed to endotoxemia:Role of cyclooxygenase-2. Surgery,2005, 138( 2):134-140.
[7]Jie Sun,Xiao-Dong Wang,Hong Liu,et al.Ketamine suppresses intestinal NF-kappa B activation and proinflammatory cytokine in endotoxic rats.World J Gastroenterol,2004,10(7):1028-1031.
[8]Taniguchi T,Takemoto Y,Kanakura H,et al．The dose-related effects of ketamine on mortality
孙文冲，裴凌
摘要：目的探讨臭氧氧化预处理是否与氯胺酮对脓毒症大鼠模型肝脏NF-κB的治疗有协同作用。方法选择健康雄性Wistar大鼠40只，随机分为5组（n=8）：对照组（control group）大鼠按照给药组对应时间腹腔注射等量生理盐水1ml/kg，内毒素（脂多糖）组和内毒素组+氯胺酮组（脂多糖+KT group）分别在注射等量生理盐水或氯胺酮前腹腔注射脂多糖20mg/kg，O3/O2+内毒素+氯胺酮组（group O3/O2+ LPS + KT）与O3/O2+内毒素组（O3/O2group+脂多糖）都是在腹腔内注射O3/O2混合物15ug/kg连续5天，末次注射24h后予脂多糖20mg/kg,而后两组分别给予氯胺酮5mg/kg或生理盐水1ml/kg。各组在注射2h后处死动物取标本，制备肝组织病理切片。SABC（Strept Avidin Blotin Complex）法测定肝组织中NF-κB的活化程度，光镜下观察肝脏组织学改变。结果对照组肝组织形态正常，NF-κB活化极少；内毒素组肝细胞明显肿胀，肝小叶结构紊乱，窦隙变宽，肝细胞和内皮细胞普遍水肿变性，部分可见局灶性坏死区，汇管区炎细胞浸润，NF-κB活化最为明显（37.139±19.294 VS7.467±6.073）（P<0.05)；O3/O2+内毒素+氯胺酮组肝组织较内毒素+氯胺酮组改变减轻，肝细胞轻度肿胀但肝组织结构尚完整，NF-κB呈低度活化（8.213±3.438VS12.500±4.685）（P<0.05)。结论脓毒症肝损伤时，O3氧化预处理可抑制NF-κB活化并协同氯胺酮的抗炎作用，从而减轻肝组织的病理损伤。
【关键词】肝脏核因子κB大鼠
Efficiencyof ketamine on nuclear factor kappa B activities is influenced after ozone oxidative preconditioning in sepsis-induced liver injury in rats.SUN Wen-chong,PEI Ling.Department of Anesthesiology, First Affiliated Hospital，China Medical University,Shenyang110001,China
【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of ozone oxidative preconditioning on serum NF-κBlevels in endotoxic shock model(rats treated with lipopolysaccharide (LPS))．Methods.Following mixture gas of 5%O3and 95% O215μg/kginjection for 5 days,20mg/kg LPS was infused after 24 hours in the group O3/O2+LPS+KT and O3/O2+LPS group,and then 5mg/kg ketamine and 1ml/kg saline was injected respectively.In addition to histological examination of the liver，the activity of NF-κB was determined by SABC immunohistochemistry were respectively measured in each group.Results Histological damage occurred in LPS group．It was characterized by hepatic arrangement turbulence，hepatic lobules distortion，congestion in liver sinusoids，hepatocyte swelling or necrosis，and granulocytes infiltration．These changes were not markedly obvious in LPS+ketamine+ozone group.Normal control group have quite low activity of NF-κB，but the activity of NF-κB was markedly increased in LPS group(P<0.05)．NF-κB level was significantly decreased in O3+ LPS+ketamine group (P<0.05)when compared with LPS+ketamine group,almost equal to control group. Conclusion The preconditioning effect of ozone seems to support the biological effectiveness of ketamine by altering the nuclear factor kappaB activity ,which may play an important role in sepsis-induced liver injury in rats．Forty healthy Wistar rats were randomly divided into 5 groups（n=8 each）：LPS treated and LPS-pretreated rats were administrated respectively with 1ml/kg saline and 5mg/kgketamine followed by infusion with 20mg/kg LPS.An equivalent amount of saline was injected in the control rats
【Key words】Liver injury; NF-κB; Rat
脓毒症是严重创伤、休克、大手术后常见的并发症，是危重病症中最常见的死亡原因[1]。它多由细菌胞壁外膜外联的脂多糖与内毒素受体相互作用而触发，再通过一系列细胞内信号转导机制激活核转录因子B(NF-κB)，促进肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)等细胞因子在体内大量表达，引发机体产生过度的炎性反应。肝脏是内毒素脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)的主要解毒器官，在脓毒症器官损害的发生、发展中具有重要调控作用。已有文献报道静脉麻醉药氯胺酮(Ketamine，KT)具有抗感染性休克和抗炎效应,可减轻脂多糖引起的肝损害，抑制NF-κB的激活[2]。随着研究的深入，臭氧已被广泛应用于临床多种疾病的治疗过程中（如疼痛性疾病，缺血性疾病等），尤其是在重度感染的防治中发挥了重要的作用[3]。本研究拟通过对脓毒症大鼠模型NF-κB活性的检测探讨O3预处理对氯胺酮抗炎作用的影响及肝组织的病理学变化。
l材料与方法
1.1材料
健康清洁级雄性Wistar大白鼠40只，SPF级，周龄6-8w，体重230-250g，供给无菌食料和饮水（由中国医科大学实验动物供应科提供）。
1.2实验分组
选择Wistar大鼠40只，随机分为5组(n=8)
Ⅰ对照组按照给药组对应时间腹腔注射等容量生理盐水1.0ml/kg
ⅡLPS +NS组将内毒素(LPS，E.coli O55:B5, Sigma公司,美国)溶于2.5ml生理盐水中，大鼠腹腔注射20mg/kg，随后注射生理盐水1.0ml/kg
ⅢLPS+氯胺酮组大鼠腹腔注射LPS（同Ⅱ），随后立即腹腔注射盐酸氯胺酮注射液5mg/kg（批号：070522，福建古田药业有限公司）
ⅣO3/O2+ LPS+氯胺酮组腹腔注射浓度40μg/mlO3/O2混合物（O3约占5%，O2约占95%）1ml（约150ug/kg）连续5天，均在9：00-10：00AM注射，末次注射24h后腹腔注射LPS（同Ⅱ），而后立即腹腔注射氯胺酮（同Ⅲ）
ⅤO3/O2+LPS+NS组腹腔注射O3/O2混合物(同Ⅳ组),末次注射24h后腹腔注射LPS（同Ⅱ），而后立即腹腔注射NS（同Ⅱ）。
各组于注射后2h处死动物，剖腹，心脏灌流后取肝脏组织。
1.3测定指标
以4%多聚甲醛200ml心脏灌流处死大鼠，取新鲜肝组织用4%多聚甲醛液固定后石蜡包埋，5-6 m厚连续切片制备石蜡切片。部分切片用SABC法进行免疫组织化学染色，严格按试剂盒使用说明操作。NF-KB单克隆抗体(McAb)(武汉博士德生物工程公司)；即用型SABC试剂盒(武汉博士德生物工程公司)
1.4形态学观察
另一部分石蜡切片进行常规HE染色，BX-51光学显微镜(Olympus公司，日本)下观察组织形态学变化。
1.5结果判定
每只动物随机取两张免疫组化切片检测肝组织NF-κB表达（以积分光密度表示），每张切片在400倍光镜下随机取五个视野，采用显微摄像系统(Olympus AX70,日本)对肝组织切片中显示细胞浆或细胞核中有棕黄色颗粒的阳性细胞进行图像采集。采用高清晰度彩色显微图像分析系统（MetaMorph/Olympus DP10/BX51，日本）对阳性细胞进行分析。用Image Pro Plus 5.0图像分析软件对积分光密度值进行统计分析，比较各组间的表达量差异。
1.6统计学处理
采用SPSS11.5统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差( x ±s)表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）,均数间的两两比较采用Dunnett-t检验，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为有非常显著性差异。
2.结果所有大鼠均顺利完成实验，各组大鼠体重差异无统计学意义（P>0.05）
2.1肝组织NF-κB表达的变化
NF-κB在细胞浆或细胞核中有棕黄色颗粒者表达，其积分光密度值见表1，Ⅰ组中大鼠肝组织NF-κB表达极少；Ⅱ组注射LPS后NF-κB的表达显著增加（P<0.05）, Ⅲ、Ⅳ组、Ⅴ较Ⅱ表达量都显著降低（P<0.05），且Ⅳ组显著低于Ⅲ组（P<0.05）；Ⅳ组NF-κB的表达量几乎下降到Ⅰ组的水平，两组相比无统计学意义（P>0.05）。
表1各组大鼠肝组织NF-κB的表达的积分光密度值比较(x ±s，n=10)
组别
例数
NF-κB
Ⅰ对照组
10
7.467±6.073
ⅡLPS+NS组
10
37.139±19.2940△
ⅢLPS+ KT组
10
12.500±4.685△*
ⅣO3/O2+ LPS+KT组
10
8.213±3.438*#
ⅤO3/O2+LPS+NS组
10
8.889±2.716*#
注：△与Ⅰ组比较, P < 0. 05 *与Ⅱ组比较,P < 0.01 #与Ⅲ组比较，P < 0.05
2.2光镜下肝病理学改变HE染色显示
Ⅰ组：肝小叶结构完整清晰，肝细胞形态结构正常，肝窦清晰，无中性粒细胞浸润（图1）；Ⅱ组：可见肝细胞明显肿胀，细胞和内皮细胞普遍水肿变性，肝小叶结构紊乱，肝界板破坏，窦隙变宽，窦腔内有炎细胞聚集成团，汇管区有较多炎细胞浸润，部分可见局灶性坏死区，部分细胞核呈碎裂状，肝血窦内有淤积的红细胞和微血栓（图2）；Ⅳ组：肝细胞轻度肿胀，但肝细胞膜完好，肝组织结构基本完整，肝血窦轻度扩张，肝组织中可见少量散在的炎性细胞浸润（图4）；Ⅲ、Ⅴ组表现类似：肝细胞明显肿胀，有的呈空泡状变性，肝血窦受压，但肝组织结构尚完整，炎性细胞在肝组织中大量散在分布（图3）。
Ⅰ组(对照组)Ⅱ组（LPS+NS组）
Ⅲ组（LPS+KT组）Ⅳ组（O3/O2+LPS+KT组）
图A对照组肝小叶结构完整清晰，肝细胞形态结构正常，无中性粒细胞浸润。HE×400
图BLPS+NS组肝细胞明显肿胀，肝小叶结构紊乱，汇管区有较多炎细胞浸润，部分可见局灶性坏死区，部分细胞核呈碎裂状。HE×400 图C LPS+ KT组肝细胞明显肿胀，有的呈空泡状变性但肝组织结构尚完整，炎性细胞在肝组织中大量散在分布。HE×400 图DO3/O2+ LPS+KT组肝细胞轻度肿胀，肝组织结构基本完整，肝组织中可见少量散在的炎性细胞浸润。HE×400
2.3 NF-κB免疫组化染色结果
在LPS组大鼠肝细胞胞浆及胞核中均有NF-κB强阳性染色，即呈棕黄色颗粒的为阳性细胞；在LPS+KT组，NF-κB的表达较LPS组减少（P<0.05）；而在O3/O2+LPS+KT组, NF-κB的表达较LPS组和LPS+KT组均减少（P<0.05）。见表1，图5~7。
图E LPS组大鼠肝细胞胞浆及胞核中均有NF-κB强阳性染色。（DAB显色，×400）图FLPS+KT组，NF-κB的表达较LPS组减少。（DAB显色，×400）图G O3/O2+LPS+KT组NF-κB的表达较LPS组和LPS+KT组均减少。（DAB显色，×400）
3.讨论
1994年，NF-κB在肝脏疾病中作为重要因子第一次被认识【4】。NF-κB是许多炎症介质表达所必需的转录因子，重要炎性因子(IL-6、IL-8)和细胞粘附分子(ICAM-1、VCAM-1)的基因启动子上都有NF-κB的结合位点，即NF-κB是促炎性细胞因子的上游基因。哺乳动物最多见的NF-κB是由P65和P5O两个蛋白亚基组成的异源二聚体，它不仅在细胞内相对稳定表达而且是最重要的可被诱导的二聚体形式。在静息状态下，NF-κB的P65亚基与NF-κB抑制物（inhibitor ofκB，IκB）蛋白结合,覆盖P65蛋白的核定位信号,以无活性状态存在于胞浆中。在LPS、前炎性细胞因子等的刺激下，IκB蛋白Ser32和Ser36发生磷酸化而被降解，NF-κB激活后移位至细胞核，与靶基因启动子序列的特定部位结合，启动和调控众多炎症介质的基因转录[5]。因此，NF-κB可被认为是极具潜力的新型抗炎靶点，如能有效地拮抗NF-κB的活化，则可高效特异地抑制IL-6等炎症介质的释放，起到以一当十、事半功倍的抗炎效果。
本研究参照文献[6]介绍的方法，建立大鼠脓毒血症肝损伤动物模型，用SABC法检测大鼠肝组织中NF-κB活性。结果表明，Ⅱ组较Ⅰ组NF-κB的活性明显升高，表明脓毒血症肝损伤模型制备成功。进一步研究发现，NF-κB活性改变与肝脏结构的改变基本一致，从而提示NF-κB可能在大鼠感染性肝脏损伤中起关键性作用。
氯胺酮是唯一一种具有镇痛作用的静脉麻醉药，其对LPS引起的肝损伤有明确的治疗作用[6]。Jie等[7]指出氯胺酮在体内/外均可抑制内毒素诱导的NF-κB活化。本研究也发现，Ⅲ组的NF-κB活性较Ⅱ组明显降低，提示经氯胺酮处理后，脓毒血症大鼠肝组织NF-κB活性下降，即氯胺酮可抑制大鼠肝脏NF-κB活化，与Jie的研究结果及Taniguchi[8]等证实氯胺酮有肝保护的结论相一致。由此推测，氯胺酮可能正是通过抑制NF-κB的活化而减少TNF-α和IL-6的合成，从而拮抗肝脏过度的炎性反应，并对感染性休克动物其它重要脏器发挥保护作用。
O3进入血液后立即降解成反应性氧产物（reactive oxygen specis，ROS），其中以H2O2最为重要。H2O2可自由进出白细胞，活化特异性蛋白激酶和基因表达。被激活的免疫细胞释放细胞因子增强机体免疫应答。有文献报道[9]O3 /O2腹腔应用可以抑制内毒素大鼠NF-κB的激活,降低TNF-α的释放,避免慢性炎症反应的产生,阻止了内毒素休克的发展。但值得注意的是，O3的毒性/治疗双重作用取决于所用O3的浓度[10]。因过低浓度的O3无法启动细胞因子的级联反应，过高浓度的O3使机体遭受较强的氧化应激损害，故O3只有在治疗窗（0-60）μg/ml [10]范围内才能在损伤细胞之前被抗氧化和清除系统识别后清除，换句话说，O3在此范围内才可作为一种药物，故本实验选择40μg/ml。结果示，Ⅴ组与Ⅱ组比较，NF-κB含量明显降低（P<0.05)，说明40μg/ml的O3 /O2混合物对脓毒症大鼠NF-κB的激活有抑制作用;同时，与Ⅲ组相比，我们发现Ⅳ组NF-κB含量明显降低（P<0.05），说明O3 /O2混合物不仅抑制脓毒症大鼠肝脏NF-κB的激活，与氯胺酮的抗炎作用也有协同效应。
正常的氧化/还原系统动态平衡是机体进行正常免疫反应的关键因素，因为ROS在宿主防御过程中是一必备因素【11】。虽然本研究未对大鼠体内的氧化还原状态进行评价，但O3 /O2预处理是通过激活包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）在内的内源性抗氧化系统来限制脓毒血症造成的过度的氧化应激状态。Jacobs等【12】也指出SOD，GSH-Px等内源性抗氧化物质增多可使脓毒症大鼠生存率升高。所以，我们认为脓毒症大鼠腹腔应用治疗量的O3 /O2混合物是通过上调体内还原系统水平来协同氯胺酮的生物学效应。
本研究我们发现LPS致肝损伤的急性期，腹腔内注射氯胺酮和治疗量的O3 /O2都可以抑制NF-κB的活化，且治疗量的O3 /O2混合物可提高氯胺酮的抗炎效果，减轻内毒血症引起的器官、组织损害，降低术后脓毒症的发病率，避免慢性炎症反应和氧化应激的产生。
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