臭氧预处理对大鼠缺血再灌注心肌的保护作用
蔡大升 裴凌
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30471666）
作者单位：110001辽宁沈阳市，中国医科大学第一临床医院麻醉2科[蔡大升、裴凌]通讯作者：裴凌
[摘要]目的探讨臭氧预处理对大鼠缺血再灌注心肌的保护作用及其作用机制。方法健康清洁级成年雄性SD大鼠20只，随机分为2组（n＝10），模型组（Mod组）、臭氧预处理组（OP组）。OP组每天在固定时间腹腔注射臭氧1.5ml(50μg/ml)，连续5天，最后一次臭氧预处理后24h建立大鼠心肌缺血再灌注模型。Mod组与OP组以3%戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉后，分别阻断左冠状动脉30min，再灌注120min。术毕经股动脉取血3 ml待测肌钙蛋白I（CTnI），取左心室缺血危险区心肌待测热休克蛋白70（HSP70）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）和Bcl-2。测定左心室缺血区及梗死区范围。结果与Mod组比较，OP组的CTnI值明显降低（P<0.05）；两组左心室缺血区的范围无显著差别，但OP组梗死区的范围要小于Mod组（P<0.05）；与Mod组比较，OP组左心室缺血危险区的HSP70和Bcl-2表达增加，Caspase-3表达降低。结论 臭氧预处理可以减少大鼠心肌梗死范围，减轻缺血危险区损伤的程度，对大鼠缺血再灌注心肌的损伤具有保护作用。
[关键词] 臭氧；预处理；心肌；缺血再灌注
Protective effects of Ozone Preconditioning on ischemia/reperfusion myocardium of RatsDa-sheng CAI, Ling PEI. *Department of Anesthesiology, First Affiliated Hospital of China Medical University Graduate School, LiaoningShenyang110001,China
[Abstract]Objective To investigate the protective effects of ozone preconditioning on ischemia/reperfusion myocardium of rats and the mechanism of action. MethodsTwenty health adult male SD rats weighing 300~350g were randomly divided into 2 groups (n = 10 each), groupⅠischemia/reperfusion (Mod); group Ⅱozone preconditioning (OP). Group Ⅱaccept ozone 1.5ml(50μg/ml) intraperitoneal injectionon on the same time daily, continuing 5 days. To establish the model of ischemia/reperfusion of rats after 24h when ozone preconditioning on the last time. The animals were anesthetized with intraperitoneal 3% pentobarbital sodium 50 mg/kg, intubated and mechanically ventilated. Femoral artery and vein were cannulated. To occluded left coronary artery for 30min, followed by reperfusion for 120min. Then 3ml blood samples were taken from femoral artery for determination troponin I (CTnI). The myocardial specimens of left ventricular ischemia dangerous areas were obtained for determination heat shock protein 70(HSP70)、Cysteine proteinase-3(Caspase-3) and Bcl-2. The sizes of left ventricular ischemia areas and infarct areas were measured.ResultsCompared with Mod group, the CTnI activities of OP group were decreased obviously (P<0.05). The sizes of left ventricular ischemia areas have no significant difference in Mod group and OP group. Nevertheless, the sizes of left ventricular infarct areas were less in OP group than Mod group (P<0.05). Compared with Mod group, the expressions of HSP70 and Bcl-2 were increased in OP group. On the otherhand, the expressions of Caspase-3 were decreased in OP group.ConclusionOzone preconditioning can reduces the size of left ventricular infarct areas，meanwhile decreases the injury extent of left ventricular ischemia dangerous areas. Accordingly, ozone preconditioning offers protective effects on ischemia/reperfusion myocardium of rats.
[Key words]Ozone; Preconditioning ; myocardium; I/R
臭氧(Ｏ3)是一种由三个氧原子组成的强氧化剂，常温下半衰期约20 min[1]，易分解和溶于水。临床上主要用于腰椎间盘突出症治疗[2]，具有消炎、止痛及溶解髓核内的蛋白多糖等作用。相关研究[3,4]显示,臭氧促进自由基清除的作用还被广泛应用于抗衰老及运动医学等领域。臭氧用于缺血再灌注（I/R）损伤的研究较少，心肌方面的研究未见报道，本研究拟探讨臭氧预处理对大鼠缺血再灌注心肌的保护作用及其作用机制。
资料与方法
健康成年雄性清洁级SD大鼠20只，体重300~350g，由中国医科大学动物中心提供，随机分为2组（n＝10），模型组（Mod组）、臭氧预处理组（OP组）。参照文献方法[5,6]，OP组每天在固定时间腹腔注射臭氧1.5ml(50μg/ml)，连续5天。
心肌缺血动物模型的制作
最后一次臭氧预处理后24h制作动物模型，术前6h禁食水，腹腔注射3%戊巴比妥钠50 mg/kg全麻。插入气管导管，连接小型动物呼吸机（Harvard 638型，美国）行人工通气，吸入纯氧，调节呼吸频率60次/min，吸呼比1:2，潮气量8-10ml/kg，维持呼气末二氧化碳分压（PETCO2）35~45mmHg（1 mmHg＝0.133kPa）。右股静脉插管用于输液，左股动脉插管用于测定动脉压，连接多导生理记录仪（RM-6200，光电，日本）连续监测心电活动。经胸骨左缘第3、4肋间处开胸，剪开心包，缝线绕过左冠状动脉前降支近端深面，线两端共穿一根聚乙烯小管以形成闭环。拉紧闭环并用止血钳固定即产生缺血，放松闭环即发生再灌注[7]，实验中以左室前壁紫绀及同步心电图标Ⅱ导联ST段抬高为结扎成功标志。两组大鼠穿线后稳定20min，记录血流动力学参数作为基础值。活结结扎冠状动脉30min，再灌注120min。
20只大鼠中4只剔除实验，每组各2只，剔除的主要原因为在冠状动脉结扎及再灌注过程中发生严重的低血压或室颤。
血流动力学参数变化：分别于穿线稳定后20min、冠状动脉阻断时、冠状动脉阻断30min后、再灌注后60 min和120min，通过多导生理记录仪连续监测心电图、平均动脉压（MAP）、心率（HR）等血流动力学参数，并同时记录心电图变化情况。
心肌梗死面积（infarct size，IS）测定：于再灌注120min后，在原部位再次结扎冠状动脉。经股静脉缓慢输注2%伊文思蓝3ml，给予过量戊巴比妥钠处死实验动物。立即摘取心脏，分离出左心室，沿纵向切成2mm厚度切片。由于左心室非缺血区被染成蓝色而与缺血危险区（ARR）区分，用解剖尖刀将非缺血区和缺血危险区心肌从左心室取下，分别置于1％的2,3,5-三苯基氯化四氮唑中（TTC，37℃，以100mmol/L磷酸缓冲液调至PH为7.4）孵育15min。非梗死心肌被染成砖红色，梗死心肌为白色。最后将切片置于10％甲醛中固定至次日，在解剖显微镜下仔细将梗死区心肌与非梗死的缺血危险区心肌分开，分别称重，测量左心室（LV）、缺血危险区（ICS）及梗死区（IFS）心肌质量（mg），并计算缺血危险区心肌质量占左室质量百分比（ICS/LV,％）及梗死心肌质量占缺血危险区心肌质量百分比（IFS/ ICS,％），以ICS/LV代表心肌缺血范围的大小，以IFS/ ICS代表心肌梗死范围的大小。
血液及心肌标本留取：于再灌注120min后，左心室抽血3ml置于真空采血管内，静置20 min后在德国Sigma离心机上以3000 r/min(r=9cm)离心10min，取上清置于灭菌子弹头内冻于-20℃冰箱内待测CTnI。伊文思蓝染色后，用解剖尖刀将缺血危险区心肌从左心室取下置于10％甲醛中固定待测。
血清CTnI的测定：CTnI采用双抗ELIASA夹心法，采用日本Olympus AU800全自动生化仪测定(参考值: CTnI<0.5ng/ml)。
免疫组织化学染色测定HSP70、Caspase-3和Bcl-2的表达：10%福尔马林溶液固定，缺血危险区心肌组织经脱水、切片后，SP法进行免疫细胞化学染色，染色步骤按试剂盒说明书进行操作。DAB显色，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片。采用显微图像分析系统（Olympus AX70/Coolsnapfx/MetaMorph）图像处理分析仪检测，每组在高倍镜下（×40）随机选择视野拍照,阳性部位呈棕黄色染色。
统计学处理应用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（`x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
结果
两组大鼠MAP、HR基础值没有显著差异。组间各时间点MAP、HR比较无显著性差异，两组在冠状动脉结扎及再灌注过程中均引起轻度MAP下降及HR轻度加快，但无显著差异。
OP组CTnI为780±116.3ng/ml，Mod组为1266±102.5ng/ml。OP组低于Mod组（P<0.05）。（见表1）
两组心肌缺血范围无明显差别，但OP组心梗范围重量、心梗范围重量占缺血区重量的百分比和心梗范围重量占左室重量的百分比皆小于Mod组(P<0 05)。（见表1）
OP组HSP70和Bcl-2的表达明显多于Mod组；OP组Caspase-3的表达明显低于Mod组。（见图1-3）
表1两组心肌梗死范围的比较及CTnI的数值（n=8, `x±s）
组别
OP组
Mod组
WLV(mg)
7085.12±458.12
7206.12±487.55
WICS(mg)
3518.13±462.08
3686.25±398.58
WIFS(mg)
1213.75±354.48
1864.18±410.57△
WICS/WLV(%)
49.52±5.53
50.97±6.57
WIFS/WICS(%)
34.83±10.28
50.36±8.50△
WIFS/WLV(%)
17.02±6.05
25.16±7.48△
CTnI(ng/ml)
780±116.3
1266±102.5△
ΔP<0.05
（图1）Caspase-3的表达：左图为Mod组，右图为OP组
（图2）HSP70的表达：左图为Mod组，右图为OP组
（图3）Bcl-2的表达：左图为Mod组，右图为OP组
讨论
心肌缺血再灌注损伤(MIRI)越来越受到重视。其发生机制多认为涉及多种细胞及生物活性物质，是以中性粒细胞(PMN)为主体的一种炎性反应过程[8]，其中钙超载、氧自由基(OFR)是两大直接损伤心肌的因素。钙超载通过干扰线粒体的正常功能、激活ATP酶，使ATP减少；OFR攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化反应，产生MDA等脂质过氧化物，破坏膜结构和功能。
臭氧预处理[9]类似于缺血预处理[10]、热休克预处理[11]和化学药物预处理[12]，能对严重的应激反应起到保护作用，降低损伤的程度。
主要机制可能为：臭氧预处理后，通过产生活性很强的自由基，使体内自由基增加，从而触发热休克蛋白合成增加及使体内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等抗氧化酶活性增高，达到了模拟缺血预处理的效果。心肌缺血再灌注损伤中存在着凋亡机制[13,14]，臭氧预处理能增加抗凋亡蛋白合成，降低促凋亡蛋白合成，从而抑制凋亡的发生。本研究结果显示：OP组的HSP70和Bcl-2的表达明显多于Mod组；Caspase-3的表达明显低于Mod组。凋亡发生机制中最关键的环节之一是Caspase家族蛋白酶的激活。其中Caspase-3是Caspase家族中重要的凋亡执行者之一，它被合成后通常以非活化的酶原形式存在于细胞质中，在多种凋亡信号刺激下经蛋白水解作用被激活成活化形式，可对多种蛋白底物进行降解，从而在细胞凋亡过程中起关键作用[15]。
HSP70是心脏组织中诱导表达最多的HSPs家族成员[16]，能与蛋白质结合，保护新合成蛋白质的恰当构型，并防止/修复应激所致的蛋白质损伤，以保护细胞功能和生存。HSP70可通过影响多种蛋白质或信号转导通路而抑制缺血再灌注或活性氧(reactive oxygen species, ROS)所致的心肌细胞凋亡，研究发现[17]HSP70在应激状态下通过其肽结合结构域与抗凋亡蛋白nucleolin在细胞核内发生相互作用，从而抑制nucleolin的断裂和心肌细胞凋亡的发生。HSP70能从多个环节干扰细胞凋亡信号通路，如HSP70能抑制P53活性和Bax的转位[18,19]；
线粒体转染HSP基因[20,21]可抑制caspases-3的活化和线粒体细胞色素C的释放，干扰凋亡启动，从而抑制缺血/再灌注所致的线粒体损伤和心肌细胞凋亡。研究表明[22,23]，HSP70表达能保护心肌细胞免于缺血/再灌注损伤，转染HSP70基因可减少兔心肌的梗死面积。Bcl-2家族是细胞凋亡调控机制中的关键的细胞内抗凋亡调控点。Bcl-2家族包含一组相关蛋白，它们分别与Bcl-2在4个保守区具有同源结构域（BH1-4）并以此作为结构基础，形成同源性或异源性二聚体，位于细胞凋亡途径的上游调节细胞的凋亡[24]。臭氧预处理增加了抗凋亡蛋白HSP70和Bcl-2合成，降低了促凋亡蛋白Caspase-3合成，从而抑制大鼠心肌缺血再灌注缺血危险区凋亡的发生。
另一方面，臭氧入血后可激活NF-κB，早期激活的NF-κB能引起IκB合成增加，与后来缺血激活的NF-κB结合使其失去活性，减轻心肌缺血再灌注损伤，上调细胞保护性蛋白的表达，在随后的缺血再灌注过程中，这些蛋白反过来抑制NF-κB的活化，减轻由NF-κB介导的心肌损伤[25]。此外，臭氧能显著降低血小板的凝聚力，降低红细胞聚集性，提高红细胞的变形能力及携氧能力，能够使红细胞滤过率增加，血液粘滞度明显降低，从而改善微循环；臭氧还能调节细胞内Ca2+浓度，提高机体免疫能力，增加机体对缺血、缺氧的耐受力[26]。
本研究结果显示，OP组血清CTnI值低于Mod组，CTnI是心肌损伤的标志物[27]，能反映心肌损伤程度。两组心肌缺血范围无明显差别，但OP组心梗范围重量、心梗范围重量占缺血区重量的百分比和心梗范围重量占左室重量的百分比皆小于Mod组。提示臭氧预处理组大鼠心肌缺血再灌注损伤程度较轻。
综上所述，臭氧预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用。表现为减少心梗的范围，减轻缺血危险区损伤的程度。用于临床有待于进一步研究。
参考文献
1Andreula CF, Simonetti L, eSantis F, etal. Minimally invasive oxygen–ozone therapy for lumbar disk herniation. Am J Neuroradiol, 2003, 24: 996-1000.
2Bocci V. Ozone as a bioregulator. Pharmacology and toxicology of ozone therapy today. J Biol Regul Homeost Agents, 1996, 10(23): 31-53.
3Larini A, Bocci V. Effects of ozone on isolated peripheral blood mononuclear cells. Toxicol In Vitro, 2005, 19(1) :55-61.
4Torossian A, Ruehlmann S, Eberhart L, etal. Pre-treatment with ozone (Ｏ3) aggravates inflammation in septic rats. Inflamm Res, 2004, 53(Suppl 2): S122-125.
5 Zullyt B, Zamora, Aluet Borrego, et al. Effects of Ozone Oxidative Preconditioning on TNF-αRelease and Antioxidant-Prooxidant Intracellular Balance in Mice During Endotoxic Shock. Mediators Inflammation, 2005(1): 16–22.
6 Bocci V. Biological and clinical effects of ozone: Has ozone therapy a future in medicine Br J Biomed Sci, 1999, 56: 270 279.
7Gho BC, Schoemaker RG, Vanden Doel MA, et al. myocardial protection by brief ischemia in noncardiac tissue [J] . Circulation, 1996, 94 (9) : 2193-2200.
8 Hansen PR. Role of neutrophils in myocardial ischemia and reperfusion. Circulation, 1995, 91: 1872-1885. [9] Leon OS, Menendez S, Merino N, et al. Ozone oxidative preconditioning: a protection against cellular damage by free radicals. Mediators Inflamm. 1998;7(4):289–294
10Murry CE, Richard VJ, Reimer KA, JenningsRB. Ischemic preconditioning slows energy metabolism and delays ultrastructural damage during a sustained ischemic episode. Circ Res. 1990; 66(4) : 913–931.
11Neschis DG, SaffordSD, Raghunath PN, et al. Thermal preconditioning before rat arterial balloon injury: limitation of injury and sustained reduction of intimal thickening. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1998; 18(1) : 120–126.
12Riepe MW, Ludolph AC. Chemical preconditioning: a cytoprotective strategy. Mol Cell Biochem. 1997; 174(1-2) : 249–254.
13Fliss H, Gatinger D. Apoptosis in Ischemic and Reperfused RatMyocardium [J] . Circ Res, 1996, 79: 949-956.
14Oliveti G, Quaini F, Sala R, etal. Acute Myocardial Infarction in Humans is as Sociated with Activation of Programmed Myocyte Cell Death in the Surviving Portion of the Heart [J] . J Mol Cell Cardial, 1996, 28: 2005-2016.
15Takahashi A. Caspase: Executioner and Undertaker of Apoptosis [J] . Int J Hematol, 1999, 70: 226-232.
16Kregel KC. Molecular Biology of Thermoregulation Invited Review: Heat shock proteins: modifying factors in physio-logical stress responses and acquired thermotolerance. J Appl Physio 2002; l 92: 2177-2186.
17Wang KK, Jiang L, Liu K, etal. Effect of heat shock protein 70 on cleavage of nucleolin induced by oxidative stress. ChinaJ Arterioscler. 2004: 12 (4) : 373-377.
18Wadhwa R, Yaguchi T, Hasan MK, etal. Hsp70 family member, mot-2/mthsp70/GRP75, binds to the cytoplasmic sequestration domain of the p53 protein. Exp Cell Res 2002; 274: 246-253.
19Stankiewicz AR, Lachapelle G, Foo CP, etal. Hsp70 inhibits heat-induced apoptosis upstream of mi-tochondria by preventing BAX translocation. J Biol Chem 2005; 280: 38729-38739.
20Suzuki K, SawaY, KagisakiK, etal. Reduction in myocardial apoptosis associated with over expression of heat shock protein 70 [J] . Basic Res Cardiol, 2000, 95(5): 397-403.
21Jayakumar J, Suzuki K, Sammut IA, etal. Heat shock protein 70 gene transfection protects mitochondrial and ventricular function against ischemia-reperfusion injury [J] . Circulation, 2001, 104: 1303-1307.
22Okubo S, Wildner O, ShahMR, etal. Gene transfer of heat shock protein 70 reduces infarct size in vivo afte rischemia/reperfusion in the rabbit heart [J] . Circulation, 2001, 103(6) : 877-881.
23Jayakumar J, Suzuki K, Khan M, etal. Gene therapy for myocardial protection: transfection of donor hearts with shock protein 70 gene pro tects cardiac function against ischemia reperfusion injury [J] . Circulation, 2000, 102(19) : 302-306.
24 Misao J, Hayakawa Y, Ohno M, etal. expression of bcl-2 protein，an inhibitor of apoptosis, and Bax, an accelerator of apoptosis, in ventricular Myocytes of human heart with myocardial infarction [J] . Circulation, 1996,94:1506.
25 Zhong C, Zhou Y, Liu H. Nuclear factor kappaB and anesthetic preconditioning during myocardial ischemia-reperfusion. Anesthesiology, 2004, 100: 540-546.
26景桂霞于军.高氧液预处理对心脏瓣膜置换术患者心肌肌钙蛋白I和心肌酶学的影响.临床麻醉学杂志. 2007, 3, 191-192.
27 Turner A, Tsamitrors M. Bellocardial cell injury inseptic shock. Crit Care Med, 1999, 27: 1775-1780.
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30471666）
作者单位：110001辽宁沈阳市，中国医科大学第一临床医院麻醉2科[蔡大升、裴凌]通讯作者：裴凌
[摘要]目的探讨臭氧预处理对大鼠缺血再灌注心肌的保护作用及其作用机制。方法健康清洁级成年雄性SD大鼠20只，随机分为2组（n＝10），模型组（Mod组）、臭氧预处理组（OP组）。OP组每天在固定时间腹腔注射臭氧1.5ml(50μg/ml)，连续5天，最后一次臭氧预处理后24h建立大鼠心肌缺血再灌注模型。Mod组与OP组以3%戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉后，分别阻断左冠状动脉30min，再灌注120min。术毕经股动脉取血3 ml待测肌钙蛋白I（CTnI），取左心室缺血危险区心肌待测热休克蛋白70（HSP70）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）和Bcl-2。测定左心室缺血区及梗死区范围。结果与Mod组比较，OP组的CTnI值明显降低（P<0.05）；两组左心室缺血区的范围无显著差别，但OP组梗死区的范围要小于Mod组（P<0.05）；与Mod组比较，OP组左心室缺血危险区的HSP70和Bcl-2表达增加，Caspase-3表达降低。结论 臭氧预处理可以减少大鼠心肌梗死范围，减轻缺血危险区损伤的程度，对大鼠缺血再灌注心肌的损伤具有保护作用。
[关键词] 臭氧；预处理；心肌；缺血再灌注
Protective effects of Ozone Preconditioning on ischemia/reperfusion myocardium of RatsDa-sheng CAI, Ling PEI. *Department of Anesthesiology, First Affiliated Hospital of China Medical University Graduate School, LiaoningShenyang110001,China
[Abstract]Objective To investigate the protective effects of ozone preconditioning on ischemia/reperfusion myocardium of rats and the mechanism of action. MethodsTwenty health adult male SD rats weighing 300~350g were randomly divided into 2 groups (n = 10 each), groupⅠischemia/reperfusion (Mod); group Ⅱozone preconditioning (OP). Group Ⅱaccept ozone 1.5ml(50μg/ml) intraperitoneal injectionon on the same time daily, continuing 5 days. To establish the model of ischemia/reperfusion of rats after 24h when ozone preconditioning on the last time. The animals were anesthetized with intraperitoneal 3% pentobarbital sodium 50 mg/kg, intubated and mechanically ventilated. Femoral artery and vein were cannulated. To occluded left coronary artery for 30min, followed by reperfusion for 120min. Then 3ml blood samples were taken from femoral artery for determination troponin I (CTnI). The myocardial specimens of left ventricular ischemia dangerous areas were obtained for determination heat shock protein 70(HSP70)、Cysteine proteinase-3(Caspase-3) and Bcl-2. The sizes of left ventricular ischemia areas and infarct areas were measured.ResultsCompared with Mod group, the CTnI activities of OP group were decreased obviously (P<0.05). The sizes of left ventricular ischemia areas have no significant difference in Mod group and OP group. Nevertheless, the sizes of left ventricular infarct areas were less in OP group than Mod group (P<0.05). Compared with Mod group, the expressions of HSP70 and Bcl-2 were increased in OP group. On the otherhand, the expressions of Caspase-3 were decreased in OP group.ConclusionOzone preconditioning can reduces the size of left ventricular infarct areas，meanwhile decreases the injury extent of left ventricular ischemia dangerous areas. Accordingly, ozone preconditioning offers protective effects on ischemia/reperfusion myocardium of rats.
[Key words]Ozone; Preconditioning ; myocardium; I/R
臭氧(Ｏ3)是一种由三个氧原子组成的强氧化剂，常温下半衰期约20 min[1]，易分解和溶于水。临床上主要用于腰椎间盘突出症治疗[2]，具有消炎、止痛及溶解髓核内的蛋白多糖等作用。相关研究[3,4]显示,臭氧促进自由基清除的作用还被广泛应用于抗衰老及运动医学等领域。臭氧用于缺血再灌注（I/R）损伤的研究较少，心肌方面的研究未见报道，本研究拟探讨臭氧预处理对大鼠缺血再灌注心肌的保护作用及其作用机制。
资料与方法
健康成年雄性清洁级SD大鼠20只，体重300~350g，由中国医科大学动物中心提供，随机分为2组（n＝10），模型组（Mod组）、臭氧预处理组（OP组）。参照文献方法[5,6]，OP组每天在固定时间腹腔注射臭氧1.5ml(50μg/ml)，连续5天。
心肌缺血动物模型的制作
最后一次臭氧预处理后24h制作动物模型，术前6h禁食水，腹腔注射3%戊巴比妥钠50 mg/kg全麻。插入气管导管，连接小型动物呼吸机（Harvard 638型，美国）行人工通气，吸入纯氧，调节呼吸频率60次/min，吸呼比1:2，潮气量8-10ml/kg，维持呼气末二氧化碳分压（PETCO2）35~45mmHg（1 mmHg＝0.133kPa）。右股静脉插管用于输液，左股动脉插管用于测定动脉压，连接多导生理记录仪（RM-6200，光电，日本）连续监测心电活动。经胸骨左缘第3、4肋间处开胸，剪开心包，缝线绕过左冠状动脉前降支近端深面，线两端共穿一根聚乙烯小管以形成闭环。拉紧闭环并用止血钳固定即产生缺血，放松闭环即发生再灌注[7]，实验中以左室前壁紫绀及同步心电图标Ⅱ导联ST段抬高为结扎成功标志。两组大鼠穿线后稳定20min，记录血流动力学参数作为基础值。活结结扎冠状动脉30min，再灌注120min。
20只大鼠中4只剔除实验，每组各2只，剔除的主要原因为在冠状动脉结扎及再灌注过程中发生严重的低血压或室颤。
血流动力学参数变化：分别于穿线稳定后20min、冠状动脉阻断时、冠状动脉阻断30min后、再灌注后60 min和120min，通过多导生理记录仪连续监测心电图、平均动脉压（MAP）、心率（HR）等血流动力学参数，并同时记录心电图变化情况。
心肌梗死面积（infarct size，IS）测定：于再灌注120min后，在原部位再次结扎冠状动脉。经股静脉缓慢输注2%伊文思蓝3ml，给予过量戊巴比妥钠处死实验动物。立即摘取心脏，分离出左心室，沿纵向切成2mm厚度切片。由于左心室非缺血区被染成蓝色而与缺血危险区（ARR）区分，用解剖尖刀将非缺血区和缺血危险区心肌从左心室取下，分别置于1％的2,3,5-三苯基氯化四氮唑中（TTC，37℃，以100mmol/L磷酸缓冲液调至PH为7.4）孵育15min。非梗死心肌被染成砖红色，梗死心肌为白色。最后将切片置于10％甲醛中固定至次日，在解剖显微镜下仔细将梗死区心肌与非梗死的缺血危险区心肌分开，分别称重，测量左心室（LV）、缺血危险区（ICS）及梗死区（IFS）心肌质量（mg），并计算缺血危险区心肌质量占左室质量百分比（ICS/LV,％）及梗死心肌质量占缺血危险区心肌质量百分比（IFS/ ICS,％），以ICS/LV代表心肌缺血范围的大小，以IFS/ ICS代表心肌梗死范围的大小。
血液及心肌标本留取：于再灌注120min后，左心室抽血3ml置于真空采血管内，静置20 min后在德国Sigma离心机上以3000 r/min(r=9cm)离心10min，取上清置于灭菌子弹头内冻于-20℃冰箱内待测CTnI。伊文思蓝染色后，用解剖尖刀将缺血危险区心肌从左心室取下置于10％甲醛中固定待测。
血清CTnI的测定：CTnI采用双抗ELIASA夹心法，采用日本Olympus AU800全自动生化仪测定(参考值: CTnI<0.5ng/ml)。
免疫组织化学染色测定HSP70、Caspase-3和Bcl-2的表达：10%福尔马林溶液固定，缺血危险区心肌组织经脱水、切片后，SP法进行免疫细胞化学染色，染色步骤按试剂盒说明书进行操作。DAB显色，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片。采用显微图像分析系统（Olympus AX70/Coolsnapfx/MetaMorph）图像处理分析仪检测，每组在高倍镜下（×40）随机选择视野拍照,阳性部位呈棕黄色染色。
统计学处理应用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（`x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
结果
两组大鼠MAP、HR基础值没有显著差异。组间各时间点MAP、HR比较无显著性差异，两组在冠状动脉结扎及再灌注过程中均引起轻度MAP下降及HR轻度加快，但无显著差异。
OP组CTnI为780±116.3ng/ml，Mod组为1266±102.5ng/ml。OP组低于Mod组（P<0.05）。（见表1）
两组心肌缺血范围无明显差别，但OP组心梗范围重量、心梗范围重量占缺血区重量的百分比和心梗范围重量占左室重量的百分比皆小于Mod组(P<0 05)。（见表1）
OP组HSP70和Bcl-2的表达明显多于Mod组；OP组Caspase-3的表达明显低于Mod组。（见图1-3）
表1两组心肌梗死范围的比较及CTnI的数值（n=8, `x±s）
组别
OP组
Mod组
WLV(mg)
7085.12±458.12
7206.12±487.55
WICS(mg)
3518.13±462.08
3686.25±398.58
WIFS(mg)
1213.75±354.48
1864.18±410.57△
WICS/WLV(%)
49.52±5.53
50.97±6.57
WIFS/WICS(%)
34.83±10.28
50.36±8.50△
WIFS/WLV(%)
17.02±6.05
25.16±7.48△
CTnI(ng/ml)
780±116.3
1266±102.5△
ΔP<0.05
（图1）Caspase-3的表达：左图为Mod组，右图为OP组
（图2）HSP70的表达：左图为Mod组，右图为OP组
（图3）Bcl-2的表达：左图为Mod组，右图为OP组
讨论
心肌缺血再灌注损伤(MIRI)越来越受到重视。其发生机制多认为涉及多种细胞及生物活性物质，是以中性粒细胞(PMN)为主体的一种炎性反应过程[8]，其中钙超载、氧自由基(OFR)是两大直接损伤心肌的因素。钙超载通过干扰线粒体的正常功能、激活ATP酶，使ATP减少；OFR攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化反应，产生MDA等脂质过氧化物，破坏膜结构和功能。
臭氧预处理[9]类似于缺血预处理[10]、热休克预处理[11]和化学药物预处理[12]，能对严重的应激反应起到保护作用，降低损伤的程度。
主要机制可能为：臭氧预处理后，通过产生活性很强的自由基，使体内自由基增加，从而触发热休克蛋白合成增加及使体内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等抗氧化酶活性增高，达到了模拟缺血预处理的效果。心肌缺血再灌注损伤中存在着凋亡机制[13,14]，臭氧预处理能增加抗凋亡蛋白合成，降低促凋亡蛋白合成，从而抑制凋亡的发生。本研究结果显示：OP组的HSP70和Bcl-2的表达明显多于Mod组；Caspase-3的表达明显低于Mod组。凋亡发生机制中最关键的环节之一是Caspase家族蛋白酶的激活。其中Caspase-3是Caspase家族中重要的凋亡执行者之一，它被合成后通常以非活化的酶原形式存在于细胞质中，在多种凋亡信号刺激下经蛋白水解作用被激活成活化形式，可对多种蛋白底物进行降解，从而在细胞凋亡过程中起关键作用[15]。
HSP70是心脏组织中诱导表达最多的HSPs家族成员[16]，能与蛋白质结合，保护新合成蛋白质的恰当构型，并防止/修复应激所致的蛋白质损伤，以保护细胞功能和生存。HSP70可通过影响多种蛋白质或信号转导通路而抑制缺血再灌注或活性氧(reactive oxygen species, ROS)所致的心肌细胞凋亡，研究发现[17]HSP70在应激状态下通过其肽结合结构域与抗凋亡蛋白nucleolin在细胞核内发生相互作用，从而抑制nucleolin的断裂和心肌细胞凋亡的发生。HSP70能从多个环节干扰细胞凋亡信号通路，如HSP70能抑制P53活性和Bax的转位[18,19]；
线粒体转染HSP基因[20,21]可抑制caspases-3的活化和线粒体细胞色素C的释放，干扰凋亡启动，从而抑制缺血/再灌注所致的线粒体损伤和心肌细胞凋亡。研究表明[22,23]，HSP70表达能保护心肌细胞免于缺血/再灌注损伤，转染HSP70基因可减少兔心肌的梗死面积。Bcl-2家族是细胞凋亡调控机制中的关键的细胞内抗凋亡调控点。Bcl-2家族包含一组相关蛋白，它们分别与Bcl-2在4个保守区具有同源结构域（BH1-4）并以此作为结构基础，形成同源性或异源性二聚体，位于细胞凋亡途径的上游调节细胞的凋亡[24]。臭氧预处理增加了抗凋亡蛋白HSP70和Bcl-2合成，降低了促凋亡蛋白Caspase-3合成，从而抑制大鼠心肌缺血再灌注缺血危险区凋亡的发生。
另一方面，臭氧入血后可激活NF-κB，早期激活的NF-κB能引起IκB合成增加，与后来缺血激活的NF-κB结合使其失去活性，减轻心肌缺血再灌注损伤，上调细胞保护性蛋白的表达，在随后的缺血再灌注过程中，这些蛋白反过来抑制NF-κB的活化，减轻由NF-κB介导的心肌损伤[25]。此外，臭氧能显著降低血小板的凝聚力，降低红细胞聚集性，提高红细胞的变形能力及携氧能力，能够使红细胞滤过率增加，血液粘滞度明显降低，从而改善微循环；臭氧还能调节细胞内Ca2+浓度，提高机体免疫能力，增加机体对缺血、缺氧的耐受力[26]。
本研究结果显示，OP组血清CTnI值低于Mod组，CTnI是心肌损伤的标志物[27]，能反映心肌损伤程度。两组心肌缺血范围无明显差别，但OP组心梗范围重量、心梗范围重量占缺血区重量的百分比和心梗范围重量占左室重量的百分比皆小于Mod组。提示臭氧预处理组大鼠心肌缺血再灌注损伤程度较轻。
综上所述，臭氧预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用。表现为减少心梗的范围，减轻缺血危险区损伤的程度。用于临床有待于进一步研究。
参考文献
1Andreula CF, Simonetti L, eSantis F, etal. Minimally invasive oxygen–ozone therapy for lumbar disk herniation. Am J Neuroradiol, 2003, 24: 996-1000.
2Bocci V. Ozone as a bioregulator. Pharmacology and toxicology of ozone therapy today. J Biol Regul Homeost Agents, 1996, 10(23): 31-53.
3Larini A, Bocci V. Effects of ozone on isolated peripheral blood mononuclear cells. Toxicol In Vitro, 2005, 19(1) :55-61.
4Torossian A, Ruehlmann S, Eberhart L, etal. Pre-treatment with ozone (Ｏ3) aggravates inflammation in septic rats. Inflamm Res, 2004, 53(Suppl 2): S122-125.
5 Zullyt B, Zamora, Aluet Borrego, et al. Effects of Ozone Oxidative Preconditioning on TNF-αRelease and Antioxidant-Prooxidant Intracellular Balance in Mice During Endotoxic Shock. Mediators Inflammation, 2005(1): 16–22.
6 Bocci V. Biological and clinical effects of ozone: Has ozone therapy a future in medicine Br J Biomed Sci, 1999, 56: 270 279.
7Gho BC, Schoemaker RG, Vanden Doel MA, et al. myocardial protection by brief ischemia in noncardiac tissue [J] . Circulation, 1996, 94 (9) : 2193-2200.
8 Hansen PR. Role of neutrophils in myocardial ischemia and reperfusion. Circulation, 1995, 91: 1872-1885. [9] Leon OS, Menendez S, Merino N, et al. Ozone oxidative preconditioning: a protection against cellular damage by free radicals. Mediators Inflamm. 1998;7(4):289–294
10Murry CE, Richard VJ, Reimer KA, JenningsRB. Ischemic preconditioning slows energy metabolism and delays ultrastructural damage during a sustained ischemic episode. Circ Res. 1990; 66(4) : 913–931.
11Neschis DG, SaffordSD, Raghunath PN, et al. Thermal preconditioning before rat arterial balloon injury: limitation of injury and sustained reduction of intimal thickening. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1998; 18(1) : 120–126.
12Riepe MW, Ludolph AC. Chemical preconditioning: a cytoprotective strategy. Mol Cell Biochem. 1997; 174(1-2) : 249–254.
13Fliss H, Gatinger D. Apoptosis in Ischemic and Reperfused RatMyocardium [J] . Circ Res, 1996, 79: 949-956.
14Oliveti G, Quaini F, Sala R, etal. Acute Myocardial Infarction in Humans is as Sociated with Activation of Programmed Myocyte Cell Death in the Surviving Portion of the Heart [J] . J Mol Cell Cardial, 1996, 28: 2005-2016.
15Takahashi A. Caspase: Executioner and Undertaker of Apoptosis [J] . Int J Hematol, 1999, 70: 226-232.
16Kregel KC. Molecular Biology of Thermoregulation Invited Review: Heat shock proteins: modifying factors in physio-logical stress responses and acquired thermotolerance. J Appl Physio 2002; l 92: 2177-2186.
17Wang KK, Jiang L, Liu K, etal. Effect of heat shock protein 70 on cleavage of nucleolin induced by oxidative stress. ChinaJ Arterioscler. 2004: 12 (4) : 373-377.
18Wadhwa R, Yaguchi T, Hasan MK, etal. Hsp70 family member, mot-2/mthsp70/GRP75, binds to the cytoplasmic sequestration domain of the p53 protein. Exp Cell Res 2002; 274: 246-253.
19Stankiewicz AR, Lachapelle G, Foo CP, etal. Hsp70 inhibits heat-induced apoptosis upstream of mi-tochondria by preventing BAX translocation. J Biol Chem 2005; 280: 38729-38739.
20Suzuki K, SawaY, KagisakiK, etal. Reduction in myocardial apoptosis associated with over expression of heat shock protein 70 [J] . Basic Res Cardiol, 2000, 95(5): 397-403.
21Jayakumar J, Suzuki K, Sammut IA, etal. Heat shock protein 70 gene transfection protects mitochondrial and ventricular function against ischemia-reperfusion injury [J] . Circulation, 2001, 104: 1303-1307.
22Okubo S, Wildner O, ShahMR, etal. Gene transfer of heat shock protein 70 reduces infarct size in vivo afte rischemia/reperfusion in the rabbit heart [J] . Circulation, 2001, 103(6) : 877-881.
23Jayakumar J, Suzuki K, Khan M, etal. Gene therapy for myocardial protection: transfection of donor hearts with shock protein 70 gene pro tects cardiac function against ischemia reperfusion injury [J] . Circulation, 2000, 102(19) : 302-306.
24 Misao J, Hayakawa Y, Ohno M, etal. expression of bcl-2 protein，an inhibitor of apoptosis, and Bax, an accelerator of apoptosis, in ventricular Myocytes of human heart with myocardial infarction [J] . Circulation, 1996,94:1506.
25 Zhong C, Zhou Y, Liu H. Nuclear factor kappaB and anesthetic preconditioning during myocardial ischemia-reperfusion. Anesthesiology, 2004, 100: 540-546.
26景桂霞于军.高氧液预处理对心脏瓣膜置换术患者心肌肌钙蛋白I和心肌酶学的影响.临床麻醉学杂志. 2007, 3, 191-192.
27 Turner A, Tsamitrors M. Bellocardial cell injury inseptic shock. Crit Care Med, 1999, 27: 1775-1780.
